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�．はじめに

　私は医学部を卒業しましてから、東京大学医学部の解剖学教室で純粋な形態学にもとづいた細胞生物学を勉強し、その後、東京都臨床医学総合研究所で生化学的研究を開始し、岡崎にあります国立生理学研究所で個体を統合的システムとして捉える生理学を勉強しました。そして、現在は、伝統ある分子生物学の講座である京都大学大学院医学研究科分子細胞情報学（旧医化学第二講座）で研究をしております。
　よく、我々の分子生物学的研究はユニークだと、純粋な分子生物学の研究者から言っていただきます。言い換えれば、「変わっている」、ということになるのかもしれません。その原因は、解剖学・生化学・生理学と渡り歩いてきた私自身の経歴によるものかもしれません。生物のある現象に興味をもち、変異体の分離や抗体や薬物による機能阻害といった手法を用いてその現象を担う遺伝子を同定するという、分子生物学の本道とは異なり、私たちの研究のスタートには、常に「形態」があります。「形あるものには機能がある」という前提のもとに、ある「形」、たとえば、ある機能が想定されている細胞内の構造に興味をもち、その構造を構成している蛋白質を分離し、その遺伝子を単離し、そして最後に、その遺伝子を利用して最初に想定した機能に関する分子生物学的解析を行うというやり方です。このような方向の研究は、私たちが研究を始めたころ、すなわちＰＣＲも質量分析によるアミノ酸配列の決定もできなかったころには、多くの技術的な困難を伴いました。しかし、ヒトやマウスの全ゲノムが決定された今、その技術的困難さはほぼすべて解消してしまっているように思います。逆に言うと、私たちが進めてきた研究手法は、いま流行りの「プロテオーム解析」の先駆けだったのかもしれません。
　本日は、バリアーという機能を担うであろうと推定されていたタイトジャンクションという構造に注目したところから始まった我々の研究について、焦点を絞ってお話したいと思います。

�．タイトジャンクションに想定されていたバリアー機能

　多細胞生物は、多くの細胞がお互いに機械的に結びつけられる（接着する）ことによって形作られていますが、これらとは全く別の観点から、細胞間の接着が多細胞生物にとって本質的に重要であることが古くから知られています。それは、「細胞間を通った物質の移動（漏れ）の制御」という観点です。　
　多細胞生物は上皮細胞に囲まれることにより、まず自己の内と外に区別されています。そして、体の中は、上皮細胞や内皮細胞のシートにより、さらにいくつものコンパートメントに分けられています。コンパートメントの中のイオン環境や蛋白質の種類・濃度などは、それぞれの機能に応じて大きく異なっていて、この環境を動的に保つことが、多細胞生物が生きていく上で必要不可欠であることはよく知られています。しかし、多細胞生物であるが故に、これらのコンパートメントを仕切る壁は細胞を並べて作らざるを得ない訳で、いくらカドヘリンなどの強力な接着分子で細胞間を結合させても、水・イオン・蛋白質などは細胞間を自由に通ってしまいます。そこで、多細胞生物が存在するためには、この細胞間を通った物質の移動（漏れ）を防ぐための特殊な接着機構が必要となります。それがタイトジャンクション（以下ＴＪ）と呼ばれる接着装置で、ここでは隣り合う細胞間の細胞膜の距離がゼロにまで近づいていて、細胞間を通った物質の移動を防いでいると考えられてきました（図１）。
　脊椎動物では、このＴＪを上皮細胞間や内皮細胞間に発達させることにより、これらの細胞シートが各コンパートメントの環境を守るバリアーとして働くことを可能としているのです。しかし、ＴＪの分子的基盤に関する我々の知識がきわめて未熟であったために、この多細胞生物にとってきわめて基本的な「バリアー」という問題に関しては、まったく分子生物学的手法による解析がなされていない状態でした。

�．タイトジャンクションと呼ばれる構造

　単層の上皮細胞では、隣り合う細胞膜（ラテラル膜）のもっともアピカルよりにＴＪと呼ばれる細胞間接着領域があり、それぞれの細胞を取り巻いています（図２）。このＴＪは特殊な接着装置で、超薄切片像で見ると、ところどころで向かい合う細胞膜間の距離がゼロにまで近づいています（ＴＪのキッシングポイントと呼ばれます）。また、凍結割断レプリカ法で観察すると、ＴＪの部分では、膜内粒子が一列に並んだストランド（ＴＪストランド）が編み目を構成しています。このような観察から、ＴＪの構造は図２のようなものであると想像されてきました。すなわち、何らかの内在性膜蛋白質が細胞膜の中で線状に重合してＴＪストランドを形成し、向かい合う細胞膜中のＴＪストランドと側面で対合することによりキッシングポイントを形成するという構造です。しかし、不思議なことに、このＴＪストランドを構成する内在性膜蛋白質の実体は長い間謎に包まれており、ＴＪストランドが特殊な脂質の逆ミセルから出来ているという脂質説も有力視されるまでになっていました。

�．ジャンクションの単離とオクルディンの発見

　我々は、もともと、カドヘリンが機能する接着装置（アドヘレンスジャンクション）の分子構築を明らかにするために、アドヘレンスジャンクションが濃縮した分画を肝臓から単離する方法を開発していましたが1)、研究の過程で、この分画にＴＪも極度に濃縮していることに気づきました2,3)（図３）。もし、ＴＪストランドが内在性膜蛋白質によって構成されているのであれば、そのような蛋白質もこの分画に濃縮している筈です。そこでこのニワトリの肝臓から得た単離分画を抗原にしてモノクローナル抗体を得ることにより、ＴＪストランドを構成する分子量６５ｋＤａの膜蛋白質を初めて同定することに成功しました4)（図４）。そこでこの膜蛋白質をオクルディン（occludin：ラテン語のocclude、閉じるの意、から）と名付け、ニワトリオクルディンのｃＤＮＡを単離したところ、新規の４回膜貫通型蛋白質であることが明らかになりました。このようにして、ＴＪストランドを構成する膜蛋白質として、ニワトリのオクルディンが初めて同定されたのは、１９９３年の暮れのことで、ＴＪの構造と機能の理解が一気に進むかと思われました。しかし、実際には、オクルディンのアミノ酸配列が種間で大きく変動していたために、マウスやヒトのオクルディンの同定は難航し、激しい国際競争の中で、徐々に充実してきた遺伝子のデータベースの中から、運良く我々がヒトのオクルディンの一部の配列を見つけ、ようやくほ乳類のオクルディンの同定に成功するまでに約3年の時間が必要でした5,6)。
　一方で、ニワトリではあるが、ＴＪの内在性膜蛋白質が見つかったということで、多くの研究室でオクルディンの機能解析が始まりました7-14)。その結果、オクルディンがＴＪストランドの形成を通して、ＴＪの機能を直接担っているということを主張する論文が次々と発表されるようになりました。しかし、我々は、当時、本当にオクルディンだけでＴＪストランドが形成されているのかどうかについて、徐々に疑問を持つようになり15)、このような疑問に直接答えるために、オクルディンの遺伝子のノックアウトを試みました。その結果、予想外なことに、オクルディンを発現しない上皮細胞でも立派なＴＪストランドのネットワークが形成されることが分かりました16,17)。この我々にとって衝撃的な事実は、オクルディンがなくてもＴＪストランドが形成される、すなわちＴＪストランドを構成する膜蛋白質はオクルディン以外に存在する、ということを意味していました。

�．単層上皮のバリアーを担うクローディンファミリーの発見

　そこで、我々は、オクルディンと何らかの意味で相互作用する膜蛋白質を探すという方向で、この未同定のＴＪ膜蛋白質を探そうとしました。yeast two-hybrid法や免疫沈降法を試みましたが成功せず、上記のジャンクションの単離分画に濃縮する膜蛋白質の中で、種々の条件下（超音波破壊や蔗糖密度勾配遠心）でオクルディンと挙動をともにするものを探しました。その結果、最終的に、電気泳動上２３ｋＤａの分子量を示す蛋白質が候補として残り、そのアミノ酸配列を決定したところ、２つのＥＳＴクローンに一致しました。これらのＥＳＴクローンから全長の遺伝子を単離したところ、互いにアミノ酸レベルで約３０％のホモロジーを示す２種類の２３ｋＤａ蛋白質をコードするｃＤＮＡが同定されました18-20)（もともとの２３ｋＤａのバンドが少なくとも２種類以上の蛋白質の混合物だったことになります）。おもしろいことに、これらの蛋白質はそのアミノ酸配列から、やはり４回膜貫通型の内在性膜蛋白質と思われたのですが、オクルディンとは全くホモロジーを示しませんでした（図５）。いずれの蛋白質もタグをつけて上皮細胞に発現させるとＴＪストランドに取り込まれることが分かりましたので、この時点でクローディン－１と－２（claudin-1,-2：ラテン語のclaudere、閉じるの意、から）と名付けました。
　このクローディンは予想も出来ないような強力なＴＪ形成能力を有していました21,22)。　クローディン－１または－２をＴＪを持たないマウスＬ線維芽細胞に強制発現させたところ、いずれの場合も、もともと細胞間接着活性を示さないＬ細胞が互いに強固に接着するようになり、さらに驚いたことに細胞間に巨大なＴＪストランドネットワークが形成されました（図６）。このことは、ＴＪストランドがクローディン－１および－２だけで再構成されることを意味しており、この像を電子顕微鏡の下で初めて見たときの感動は今でも忘れられません。
　一方で、クローディン－１と－２の存在は、クローディン遺伝子がファミリーを形成していることを意味していました。そこで、我々は、データベースをもとに、クローディン－１と－２に配列の似た遺伝子を同定していったところ、最終的にクローディンファミリーはマウスで少なくとも２４種類のメンバーからなり、これらのクローディンが各臓器で複雑な組み合わせで発現していることが明らかになりました20,23-25)（図７）。さらに、ここでは少し複雑になりますので省略しますが、細胞レベルでの詳細な解析により、「２種類以上のクローディンが共重合してヘテロポリマーであるＴＪストランドを形成し、向かい合う細胞膜中のストランドどうしがクローディン間のヘテロフィリックな接着により対合して、細胞膜間の距離をゼロにしているのが、ＴＪである」ということが分かりました26)（図８）。
　次に、当然、これらのクローディン分子が、ＴＪのバリアー機能を本当に担っているのかということが問題になりました。クローディンが実際にＴＪストランドを作るのですから、ＴＪのバリアー機能に直接かかわっていることは当然のように思えるのですが、ＴＪのバリアー機能に関しては、古くから多くの詳細な生理学的解析がなされており、これらが２４種類のクローディンによってどのように説明されるのであろうか、ということが大きな問題になってきました。この問題も、多細胞生物のバリアーを考える上で、きわめて本質的な問題ですが、あまりにも専門的になりますので、ここではその詳細は省略させていただきます。ただ、我々の研究から明らかになったことを箇条書きにしますと、次のようになります。
１．クローディンは隣り合った細胞との間で対合するＴＪストランドを形成することで、ＴＪのバリアー機能を直接担っている27,28)。
２．ＴＪストランドのバリアー機能には、かなりタイトなものから、かなりルーズなものまであることが知られていたが、それは対合するＴＪストランドを構成するクローディンの組み合わせと、その混合比によって決定されている。言い換えれば、ぞれぞれ単独でもＴＪストランドを形成できる２４種類ものクローディンが存在する意味は、種々のレベルの透過性を持ったＴＪストランドを作るためではないかと考えられる29,30)。

�．重層上皮のバリアーとクローディン

　これまでの議論は一層の細胞からなる単層上皮に絞って行ってきました31-33)。しかし、実際には、多層の細胞からなる「重層上皮」も、多細胞生物の体を外界から隔離し、また、体の中に多くのコンパートメントを作るために重要な役割を果たしています。特に、体の表面の大部分を覆う表皮は、典型的な重層扁平上皮で、そのバリアー機能は我々の生存にとって必要不可欠なものです。一般に表皮は、真皮側から、基底層、有棘層、顆粒層、角質層の４層からなるとされています。これまで重層上皮にはＴＪは存在せず、そのバリアー機能の多くは、死んだ細胞からなる角質層によって担われていると広く信じられてきました。我々は、ノックアウトマウスの解析から、ごく最近、この従来の考えを根本から覆すことになりました。
　我々は、個体レベルにおけるクローディンの機能を調べるために、最近いくつかのクローディン遺伝子を破壊したマウスの作製を始めました。最初に得られたクローディン－１ノックアウトマウスは、一見正常に生まれてきましたが、２４時間以内に皮膚からの水分の蒸散量が異常に多いために脱水に陥り、すべてが死んでいきました34)（図９）。そこで、我々は、表皮にはＴＪが存在しないというこれまでの教科書的な記載が間違っているのではないかと考え、詳細な検討を行ないました。その結果、予想通り、重層上皮である表皮でも顆粒層に連続したＴＪが存在し、このＴＪはクローディン－１と－４（およびオクルディン）から出来ていることが明らかになりました（図１０）。クローディン－１ノックアウトマウスの表皮でも、クローディン－４からなるＴＪは連続して顆粒層に存在していましたが、皮下に注射したトレーサーが正常な皮膚ではＴＪより体表面側に漏れないのに対して、クローディン－１を欠損した皮膚では明らかに漏れることが分かりました。
　以上の発見は、ＴＪ、特に、クローディンが、単層上皮だけでなく、重層上皮のバリアーにおいても中心的役割を果たしていることを初めて示したもので、皮膚科学をはじめとする医学生物学に大きな驚きを与えたと思います35-37)。

�．おわりに

　以上、我々がオクルディン、そしてクローディンの同定を機に切り開いてきた「バリアーの分子生物学」とでも呼ぶべき研究分野の現状を簡単に紹介させていただきました。これからは、ＴＪのバリアー機能、およびその調節機能が、多細胞生物の個体形成の上でどのように重要な役割を果たしているかが、それぞれのクローディン遺伝子のノックアウトマウスの作製をはじめとする種々の解析により、急速に明らかにされていくと思います。また、バリアー機能の異常、特にクローディン機能の異常とさまざまな疾患・病態との関係も明らかになってくると思います38-40)。すでに２つのヒトの遺伝性疾患（遺伝性低マグネシウム血症と遺伝性難聴）がそれぞれクローディン－１６と－１４の変異により引き起こされることが報告されていますし33)、マウスの解析から考えると、バリアー障害を伴ったヒトの遺伝性の皮膚疾患の中にクローディンの変異が見つかる可能性も高いと思われています。クローディンに関連したヒト遺伝病の同定は、これから急速に進むでしょう。
　一方で、我々は、クローディンの機能不全と喘息・アトピー・クローン病などの慢性炎症との関係にも興味を持っています。また、クローディンの発現や機能を操作することによってＴＪのバリアー機能を人為的に操作する方法が確立できれば、医学的意義は大きいと思います。実際に、最近、脳血管に大量に発現しているクローディン－５のノックアウトマウスでは、低分子量物質に対する脳血管関門が破壊されていることを見いだしており、クローディンをターゲットとした新しいドラッグデリバリー法の開発も現実的なものになってくるかもしれません。
　今日は、全く触れませんでしたが、クローディンの発見によって、上皮細胞や内皮細胞の極性形成におけるＴＪの役割の理解も分子レベルで深まりつつあります。ＴＪストランドは、アピカル膜ドメインとバソラテラル膜ドメインの間に、オイルフェンスのように張り巡らされているため、二つのドメインを分ける役割（フェンス機能）を果たしています。また、ＴＪストランドの細胞質側には、オクルディン・クローディンと直接結合するZO-1、ZO-2、ZO-3などの裏打ち蛋白質の他に、種々の上皮細胞の形態形成シグナルを担うと思われる因子が集積していることが最近明らかになりつつあります。このような極性形成シグナル伝達のセンターの一つとしてのＴＪの役割の解析も、クローディンの同定により急速に進展してくるものと思われます41-49)。

文献

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